SILAC
SILAC(stable isotope labeling by amino acids in cell culture)은 세포 배양에서 안정 동위원소로 표지한 아미노산을 이용해 단백질의 양을 비교하는 단백체학 기법이다. 서로 다른 조건에서 배양한 세포의 단백질을 표지한 뒤 섞어 질량 분석법으로 분석하면, 같은 펩타이드의 동위원소 조성에 따른 질량 차이와 신호 세기를 이용해 단백질 발현량을 상대적으로 정량할 수 있다. 영어 이름을 줄인 SILAC이 국내 연구와 특허에서 주로 쓰이며, 문헌에 따라 stable isotope labeling with amino acids in cell culture로도 풀어 쓴다.[1]
원리
[편집]SILAC에서는 같은 세포주를 둘 이상의 집단으로 나누어 배양한다. 한 집단에는 일반적인 아미노산이 들어 있는 배지를 사용하고, 다른 집단에는 탄소-13이나 질소-15처럼 방사능을 띠지 않는 무거운 동위원소로 표지한 라이신·아르기닌 등의 아미노산이 들어 있는 배지를 사용한다. 세포가 증식하면서 표지 아미노산을 단백질에 편입하므로, 단백질을 효소로 분해한 뒤 얻는 펩타이드에도 일정한 질량 차이가 생긴다.[1]
표지된 세포와 표지하지 않은 세포에서 추출한 단백질은 보통 시료 전처리 단계에서 섞는다. 이렇게 하면 두 조건의 펩타이드가 같은 액체 크로마토그래피와 질량 분석 조건을 거치므로, 별도로 측정한 시료를 나중에 비교하는 방법보다 실험 조건의 차이를 줄일 수 있다. 질량 분석기에서는 화학적으로 같은 펩타이드가 서로 다른 질량 대 전하비를 가진 쌍으로 나타나며, 두 신호의 세기 비가 두 세포 집단에서 해당 단백질이 존재하는 양의 비에 대응한다.[1][2]
표지의 질량 차이는 사용하는 아미노산과 동위원소 조합에 따라 정해진다. 예를 들어 아르기닌의 탄소-13 표지는 펩타이드의 질량을 증가시키며, 분석 소프트웨어는 표지된 펩타이드와 표지되지 않은 펩타이드의 신호를 짝지어 정량한다. 여러 표지 조합을 사용하면 한 번의 질량 분석에서 세 개 이상의 조건을 비교하는 다중화도 가능하지만, 각 표지의 질량 차이를 분해할 수 있는 기기의 해상도와 표지 효율을 함께 고려해야 한다.[3]
활용
[편집]SILAC은 두 세포 상태에서 단백질 발현량을 비교하는 정량적 단백체학에 사용된다. 세포 신호 전달, 약물 반응, 분화와 스트레스 반응에서 단백질의 증가·감소를 동시에 측정할 수 있고, 번역 후 변형이나 단백질의 특정 변형 부위도 비교할 수 있다. 예를 들어 동위원소로 표지한 티로신을 이용하면 티로신 키네이스 신호 전달 경로의 기질을 추적할 수 있다.[4]
서로 다른 조건의 세포를 섞어 분석하는 특성은 단백질 상호작용 연구에도 활용된다. 특정 단백질을 정제하거나 결합시킨 뒤 함께 회수되는 단백질을 SILAC으로 정량하면, 대조군과 비교해 특이적으로 농축된 상호작용 단백질을 찾을 수 있다. 세포가 분비하는 단백질과 배지에 들어 있는 혈청 단백질을 구별하는 분비체학 연구에도 응용된다.[5]
변형 기법
[편집]펄스 SILAC(pulsed SILAC)은 표지 아미노산을 배지에 짧은 시간 동안만 넣어 새로 합성되는 단백질의 생성 속도를 추적하는 방법이다. 단백질의 총량뿐 아니라 번역과 분해에 따른 동역학을 측정할 수 있어 단백질 회전율 연구에 이용된다.[6]
NeuCode SILAC은 무거운 동위원소를 포함한 아미노산의 질량 결함을 이용해 표지 조합을 늘리는 방법이다. 질량 차이가 작기 때문에 높은 질량 분해능을 가진 질량 분석기가 필요하지만, 기존 SILAC보다 많은 시료를 동시에 비교할 수 있다.[7]
한계
[편집]SILAC은 표지 아미노산이 세포의 단백질에 충분히 편입되어야 하므로 여러 세대 동안 세포를 배양해야 하는 경우가 많다. 세포주가 표지 아미노산을 제대로 이용하지 못하거나, 표지에 따른 성장 속도 차이가 생기면 정량 결과에 편향이 생길 수 있다. 표지 효율, 세포 증식, 시료 혼합 비율과 질량 분석기의 검출 범위가 정량 결과에 영향을 준다. 배양이 어려운 조직이나 생체 시료에는 SILAC을 직접 적용하기 어려워, 화학적 표지나 비표지 정량법을 함께 사용하기도 한다.[8]
같이 보기
[편집]각주
[편집]- 1 2 3 Ong, Shaw Yi; Blagoev, Blagoy; Kratchmarova, Irina; Kristensen, Dan Bach; Steen, Hanno; Pandey, Akhilesh; Mann, Matthias (2002). “Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics”. 《Molecular & Cellular Proteomics》 1 (5): 376–386. doi:10.1074/mcp.M200025-MCP200.
- ↑ Ong, Shaw E.; Mann, Matthias (2006). “A practical recipe for stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC)”. 《Nature Protocols》 1 (6): 2650–2660. doi:10.1038/nprot.2006.427.
- ↑ Merrill, Alex E.; Hebert, Adam S.; MacGilvray, Michael E.; Rose, Christopher M.; Bailey, David J. (2014). “NeuCode labels for relative protein quantification”. 《Molecular & Cellular Proteomics》 13 (9): 2503–2512. doi:10.1074/mcp.M114.040287.
- ↑ Ibarrola, N.; Molina, H.; Iwahori, A.; Pandey, A. (2004). “A novel proteomic approach for specific identification of tyrosine kinase substrates using [13C]tyrosine”. 《Journal of Biological Chemistry》 279 (16): 15805–15813. doi:10.1074/jbc.M311714200.
- ↑ Hathout, Y (2007). “Approaches to the study of the cell secretome”. 《Expert Review of Proteomics》 4 (2): 239–248. doi:10.1586/1478-9450.4.2.239.
- ↑ Schwanhäusser, Bruno; Gossen, Maike; Dittmar, Gunnar; Selbach, Matthias (2009). “Global analysis of cellular protein translation by pulsed SILAC”. 《Proteomics》 9 (1): 205–209. doi:10.1002/pmic.200800275.
- ↑ Merrill, Alex E.; Hebert, Adam S.; MacGilvray, Michael E. (2014). “NeuCode labels for relative protein quantification”. 《Molecular & Cellular Proteomics》 13 (9): 2503–2512. doi:10.1074/mcp.M114.040287.
- ↑ Ong, Shaw E.; Mann, Matthias (2006). “A practical recipe for stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC)”. 《Nature Protocols》 1 (6): 2650–2660. doi:10.1038/nprot.2006.427.